Tiêu đề PROSEDUR SEMENTARA PRAKTIKUM TOKSIKOLOGI 2.pdf ✅

ANALISA KUANTITATIF COHb Metode Hinsberg-Lang 1. Tujuan Menentukan kadar Karboksihemoglobin (COHb) 2. Prinsip Penambahan senyawa ditionit diperlukan untuk mereduksi atau menghilangkan senyawa oksihemoglobin dan MetHb yang bisa mengganggu pembacaan absorbansi senyawa COHb. 3. Alat dan Reagen Alat : tabung reaksi 10 mL, Spektrofotometer, Flakon, 2 kuvet , Spuit 3 mL, Tourniket, Pipet ukur 5 mL, Mikropipet ( 10μL – 100μL ), Yellow tip, Rak tabung reaksi, Spatula Reagen : Ammonium hidroksida 0,1 % , Sodium dithionit 4. Sampel Whole Blood 5. Prosedur Pengambilan Darah Vena a. Menyiapkan spuit yang masih baru dan berfungsi dengan baik. b. Memasang tornikuet pada lengan atas yaitu sekitar 5 cm di atas siku. c. Mengoleskan alkohol pada tempat yang akan diambil darahnya. d. Mengambil darah sebanyak 3 mL dengan menggunakan spuit. e. Memasukkan sebanyak 0,5 mL sampel darah ke dalam flakon yang sebelumnya telah ditambahkan EDTA untuk membuat whole blood (WB). f. Memasukkan sisa sampel darah ke dalam tabung EDTA. Pengukuran Kadar COHb a. Mengambil amonium hidroksida 0,1 % sebanyak 20 mL dan memasukkannya ke dalam erlenmeyer. b. Mengambil sampel whole blood sebanyak 10 μL dengan menggunakan yellow tip. c. Memasukkan sampel whole blood ke dalam erlenmeyer yang telah berisi amonium hidroksida 0,1% (langkah 1).
d. Memisahkan campuran dari tabung erlenmeyer ke dalam 2 tabung reaksi (tabung 1 dan tabung 2), masing–masing sebanyak 5 mL, dengan ketentuan : Tabung 1 : tidak ditambah sodium dithionit Tabung 2 : ditambah sodium dithionit sebanyak 1 spatula e. Memasukkan campuran pada masing-masing tabung reaksi, ke 2 kuvet (setinggi kurang lebih 7/8 tabung kuvet) f. Mengukur absorbansi campuran pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm (atau panjang gelombang maksimum yang telah diukur). g. Menghitung kadar karboksihemoglobin (COHb) menggunakan Persamaan : Kadar COHb = ∆A ∆ArHb x 6,08% Keterangan : Δ A adalah absorbansi tabung 1 Δ ArHb adalah absorbansi tabung 2 6,08 adalah faktor konversi persen saturasi CO dalam Hb Nilai Normal COHb darah : 1. Normal : < 2% 2. Batas Toleransi : 2 – 5% 3. Mulai Timbul Gejala / Tidak Normal / Keracunan : > 5% (Nilai Keracunan COHb darah harus mempertimbangkan berbagai faktor) (Rahayu & Solihat, 2018)
ANALISA KUANTITATIF COHb Metode Conway 1. Tujuan Menentukan kadar Karboksihemoglobin (COHb) 2. Prinsip Asam sulfat digunakan untuk melepaskan karbon monoksida dari molekul hemoglobin. CO kemudian berdifusi ke larutan PdCl2 dan mereduksi ion Pd2+ menjadi logam Pd yang muncul sebagai cermin paladium di permukaan larutan PdCl2 3. Alat dan Reagen Alat : Spuit 3mL, tourniket, tabung vakutainer, holder, kapas alkohol, pipet ukur 5mL, mikropipet (10L – 1000L), yellow tip, cawan Conway, labu ukur , kuvet, spektrofotometer UV-Vis. Reagen : Alkohol 70%, KI 5%, PdCl2 0,005 N, H2SO4 5N 4. Sampel Darah vena, arteri, atau kapiler yang utuh atau yang telah hemolisis. Antikoagulan yang dapat diterima adalah EDTA dan heparin. Volume minimum sampel minimum adalah 500 μL. 5. Prosedur Kerja Pengambilan Darah Vena a. Menyiapkan spuit yang masih baru dan berfungsi dengan baik. b. Memasang torniket pada lengan tangan sekitar 5 cm diatas lipatan siku. c. Membersihkan daerah pengambilan darah dengan alkohol 70% dan membiarkan hingga kering. d. Melakukan pengambilan darah menggunakan spuit. e. Merenggangkan tourniket dan perlahan tmenarik pengisap spuit hingga spuit terisi darah 2 – 3 mL. f. Menaruh kapas di atas jarum, kemudian mencabut spuit. g. Menekan tempat tusukan dengan kapas selama beberapa saat. h. Memasukkan darah tersebut ke dalam tabung vakutainer. i. Menghomogenkan sampel dengan cara membolak balik tabung sampel secara vertikal. Penentuan Panjang Gelombang Maksimal a. Memasukkan 10 mL aquades dalam labu takar 25 mL. b. Menambahkan 1 mL KI 5% dan 0,20 mL PdCl2 0,005 N.
c. Menambahkan aquades sampai tanda. d. Membaca absorbansi pada panjang gelombang 350 – 550 nm. Penentuan Operating Time a. Memasukkan 10 mL aquades dalam labu takar 25 mL. b. Menambahkan 0,25 mL darah. c. Menambahkan 1 mL KI 5% dan 0,20 mL PdCl2 0,005 N. d. Menambahkan aquades sampai tanda tera. e. Mengukur absorbansi larutan tersebut pada menit ke 60 dan 120 dengan λ maksimal. Pembuatan kurva baku a. Menyiapkan 6 buah labu ukur 25 mL, dan mengisi masing-masing labu ukur dengan10 mL akuades dan 1 mL KI 5%. b. Menambahkan larutan PdCl2 0,005 N ke dalam labu ukur 1 – 6 dengan volume berturut-turut 0,35 mL, 0,40 mL, 0,45 mL, 0,50 mL, 0,55 mL, 0,60 mL. c. Menambahkan akuades sampai batas, mengocoknya hingga homogen. d. Mengukur absorbansi larutan pada panjang gelombang maksimal. Penentuan kadar COHb a. Mencuci bagian ceruk conway dengan cairan pembersih, kemudian dengan akuades. b. Mengisi ceruk cawan conway sebagai berikut : A = 1,5 mL akuades, B = 0,2 mL H2SO4 5N, C = 1,0 mL larutan PdCl2. c. Menambahkan 0,25 mL darah pada bagian A yang berisi akuades. d. Menutup cawan conway dan menginkubasi selama operating time. e. Setelah operating time terpenuhi, memipet 0,25 mL larutan PdCl2, ujung pipet harus menyentuh dasar agar lapisan tipis logam Pd tidak terhisap. f. Menuang isi pipet ke dalam labu ukur 25 mL yang sebelumnya telah diisi 10 mL akuades dan 1 mL KI 5 %. g. Menambahkan akuades sampai tanda tera, kemudian menghomogenkan. h. Mengukur absorbansi larutan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ maksimal. i. Menggunakan akuades sebagai blangko. j. Membuat plot absorbansi pada kurva standar untuk mendapatkan konsentrasi COHb (Rahayu & Solihat, 2018)