Tiêu đề Clase 3 (2)-Identificación bacteriana.pdf ✅

1 En general la microscopia se utiliza en microbiología para dos fines básicos: la detección inicial de microorganismos y la identificación preliminar o definitiva de los mismos. Métodos de estudio Estudio directo La muestra se puede suspender en agua o suero salino (preparación en fresco), mezclada con un álcali para disolver el material de fondo (método de hidróxido potásico [KOH]) o mezclada con una combinación de un álcali y un colorante para generar contraste (p. ej. azul de algodón lactofenol, yodo). El colorante tiñe de manera inespecífica el material celular, lo que aumenta el contraste con el fondo y permite el estudio de las estructuras detalladas. Este método se utiliza para detectar cápsulas alrededor de microorganismos. Tinciones diferenciales La tinción de Gram es la tinción mejor conocida y más utilizada, y forma la base de la clasificación fenotípica de las bacterias. Las levaduras también se pueden teñir con este método (las levaduras son grampositivas). Las tinciones de hematoxilina férrica y tricrómica son sumamente útiles para la identificación de parásitos protozoarios, y la tinción de Wright-Giemsa se utiliza para identificar parásitos sanguíneos y otros microorganismos seleccionados. Tinciones acidorresistentes El método de Ziehl-Neelsen es el más antiguo que se utiliza, aunque precisa el calentamiento de la muestra durante el procedimiento de tinción. Los microorganismos aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro. Tinciones fluorescentes La presencia de microorganismos fluorescentes es un método rápido tanto para la detección como para la identificación del microorganismo. Cultivo in vitro Identificación bacteriana
2 El éxito de los métodos de cultivo depende de la biología del microorganismo, del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria del paciente frente a la misma y de la calidad del medio de cultivo. En muchas infecciones, el germen responsable de la infección se asocia a otros muchos gérmenes que son parte de la flora microbiana normal de la región infectada. Medios no selectivos enriquecidos Estos medios están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de los gérmenes que no necesitan unas condiciones exigentes. Medios selectivos y diferenciales Los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar gérmenes específicos que pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej., un patógeno entérico en las heces). Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados. Medios especializados Se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar gérmenes específicos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros. Cultivo celular Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes intracelulares estrictos, de forma que sólo se pueden cultivar en células vivas. Detección de material genético microbiano La estructura del genoma y la secuencia genética constituyen dos características fundamentales para la distinción de la familia, el tipo y la cepa de un microorganismo. Detección, amplificación y secuenciado de ácidos nucleicos Las sondas de ADN se pueden utilizar de manera semejante a los anticuerpos, como herramientas sensibles y específicas para detectar, localizar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos específicos en muestras clínicas. La especificidad y la sensibilidad de las técnicas basadas en sondas de ADN permiten detectar especies o cepas de un agente infeccioso, incluso en ausencia de proliferación o replicación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica copias simples de ADN vírico varios millones de veces y constituye una de las técnicas más modernas de análisis genético. Se incuba la muestra con dos oligómeros cortos de ADN, denominados primers, los cuales contienen unas secuencias complementarias a las de los extremos de una secuencia genética conocida del ADN completo, una polimerasa de ADN dotada de estabilidad térmica (Taq u otra polimerasa obtenida a partir de bacterias termofílicas), nucleótidos y tampones. Los oligómeros se hibridan con la secuencia apropiada de ADN y actúan como primers para la polimerasa, la cual copia ese segmento de ADN. Posteriormente se calienta la muestra con el propósito de desnaturalizar el ADN (separar las cadenas de la doble hélice) y se enfría para permitir la hibridación de los primers con el nuevo ADN formado en el ciclo anterior.
3 Detección de proteínas En algunos casos, los virus y otros agentes infecciosos se pueden detectar por el hallazgo de ciertas enzimas características o proteínas específicas. Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características «observables» de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. El cultivo, cuando es factible, continúa siendo el método diagnóstico de elección; permite el aislamiento del microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación. Existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de conseguir una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias. Estos sistemas pueden ser manuales y automatizados. Entre ellos: Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas Se trata de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que permiten realizar simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas. Los resultados de las pruebas se expresan de forma numérica. Cada especie está definida por un código numérico, resultado de la codificación de las reacciones a las pruebas que se hubieran utilizado. → Si una prueba cualquiera es negativa, se le asigna un valor de 0 (cero) a la prueba. → Si la primera prueba es positiva, se asigna un valor de 1. → Si la segunda prueba es positiva, se asigna un valor de 2. → Si la tercera prueba es positiva, se asigna un valor de 4. Sistemas comerciales automatizados Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un índice alto de fiabilidad la identificación del microorganismo. La ausencia de concordancia entre las características observables, morfológicas y/o fenotípicas del aislamiento en estudio y las correspondientes a la(s) cepa(s) de la especie tipo, hacen que los métodos fenotípicos realicen la identificación más probable y no definitiva. El ARNr 16s (rrs) Es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs o ADN ribosomal ARNr 16S (ADN 16S) incluido en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. De distribución universal, componente crítico en la función celular, el ARNr 16S actúa como un cronómetro molecular al presentar un alto grado de conservación. Rpob (subunidad B de la ARN polimerasa)