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Una volta prodotta la molecola di DNA ricombinante andrò a clonarla attraverso un processo chiamato trasformazione. I vettori I vettori sono molecole di DNA che possiedono una serie di caratteristiche fondamentali: 1) Origine di replicazione autonoma, una sequenza di replicazione autonoma che chiamiamo OriC (negli eucarioti le troviamo sotto nome di ARS). (In questo caso si parla di OriC perché il plasmide deriva dalla cellula procariotica e perché normalmente si clona in un batterio) 2) Gene marcatore (o marcatore selettivo dominante), consente di capire se si è riusciti ad inserire il vettore con l’inserto nella cellula, non sempre si riesce ad inserirlo perché la ligazione non è semplice e la sua efficienza non è altissima. Può capitare che l’anello di DNA si richiuda senza che l’inserto sia stato inserito. 3) Siti unici per gli enzimi di restrizione 5 Ricordiamo che gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che tagliano all’interno del sito di restrizione. Consideriamo una molecola circolare (vettore) come quella rappresentata nell’immagine superiore, consideriamo l’enzima Hae II, possiamo osservare che tale enzima presenta numerosi siti, dunque questo vettore (vettore plasmidico di clonaggio Pbr322, di tipo naturale) non è adatto per fare
clonaggio, dato che nel momento in cui avvio una digestione lo frammento vista la presenza di più siti di restrizione. In questo caso dovrò modificare il vettore, possiamo notare inoltre la presenza di un’origine di replicazione e di un marcatore selettivo dominante ampR e tetR (amp: ampicillina e tet: tetraciclina, mentre R sta per resistente), nel momento in cui volessi trasformare un batterio andrò a scegliere un batterio sensibile ad esempio alla ampicillina: ampS (batterio che se messo in coltura con ampicillina non sopravvive), dopo aver aggiunto il vettore con il gene che dà resistenza all’ampicillina il batterio diventerà resistente. Dato che questo vettore presenta più siti di restrizione preferiamo utilizzare vettori modificati, come ad esempio il pUC19. È chiaro che i vettori sono in continua evoluzione, però possiamo individuare le caratteristiche che deve avere un vettore, le famiglie dei vettori, questo favorirà anche la comprensione di articoli scientifici. Il pUC19, come tutti gli altri vettori, ha un’origine di replicazione oriC, e questo mi fa capire che utilizzerò questo vettore per fare clonaggio nei batteri (nel caso dovessi trovare sia OriC che ARS sarò in presenza di un vettore che può essere veicolato sia nelle cellule eucariotiche che procariotiche), possiamo trovare inoltre il (gene) marcatore selettivo dominante (selettivo perché consente di selezionare le colonie che sono state trasformate e dominante perché si manifesta sempre), inoltre possiamo osservare i siti di restrizione raccolti tutti in un’unica regione (nell’immagine regione piccola di colore fucsia) chiamata sito di clonazione multiplo o poli linker, vediamo come abbiamo siti unici come quelli che servono a noi: Sac I è presente una volta, Hind III è presente una volta etc. La regione poli linker si trova all’interno di una regione (nell’immagine è di color azzuro chiaro), questa regione prende il nome di LacZ+, già visto perché è il gene che codifica la beta galattosidasi che ricaviamo dall’operone Lac.
Se vado a tagliare il poli linker ed inserisco l’inserto (in blu nell’immagine), ottengo un’interruzione della cornice di lettura del gene lacZ (l’ho interrotta andando ad inserire il gene di mio interesse) per cui non verrà prodotta beta galattosidasi e avrò alla fine colonie bianche (non avverrà alcuna reazione colorimetrica), quando invece non la vado ad interrompere, il gene lacZ produce la beta galattosidasi, quest’ultima in presenza di x-gal mi dà la colorazione blu delle colonie (reazione colorimetrica). Se ho colonie bianche ho la prova che non solo sono riuscito ad inserire il vettore ma anche l’inserto. Ho due livelli di controllo: -Nel terreno di coltura se in presenza dell’ampicillina la colonia non cresce vuol dire che non sono riuscito a trasformare il batterio, se viceversa questa cresce vuol dire che ho trasformato il batterio (ho inserito il vettore) -Per sapere se oltre al vettore sono riuscito ad inserire l’inserto devo valutare l’interruzione del gene lacZ, le colonie bianche mi indicano che sono riuscito ad inserire l’inserto insieme al vettore, le colonie blu avranno ricevuto solo il vettore. DOMANDA: il poli linker è presente fisiologicamente all’interno di questo vettore? RISPOSTA: no, lo abbiamo costruito noi, non si tratta in questo caso di un vettore naturale, si tratta di un vettore modificato. COLONIE BLU E BIANCHE IMPORTANTE: il nostro gene d’interesse (inserto) viene sempre tagliato con gli stessi enzimi di restrizione che vengono poi utilizzati per tagliare il vettore.