Title Biologia Lezione 39.pdf ✅

Lezione Biologia Applicata - 19/05/2021 Prof.ssa Sidoti Lo studio dei trascrittomi e la tecnica dei microarrays In tutti gli articoli medico-scientifici troveremo una parte dedicata alla Biologia Molecolare, che ci permette di comprendere il meccanismo delle patologie e i possibili target da prendere in considerazione per sviluppare una terapia. Cosa ha in relazione la pratica medica quotidiana (la professoressa fa l'esempio della neurochirurgia e della neuroradiologia) con lo studio delle malattie genetiche rare oppure dei trascrittomi. Sono importanti perché per conoscere il meccanismo di patologie ritenute rare (come le MAV, Malformazioni Artero-Venose) è necessario fare riferimento allo studio dei trascrittomi. Il neuroradiologo in realtà attraverso l'identificazione di Bio-Marcatori potrà fare una classificazione delle varie forme delle MAV, potrà immaginare un follow-up diverso basandosi su informazioni molecolari che ci consentono di fare la differenza tra un individuo ed un altro, quella che viene identificata come Medicina Personalizzata. Specifica per quella categorie di soggetti, la patologia rimane la stessa ma ci sono una serie di gradi della malattia e quindi i pazienti possono essere seguiti tramite una terapia personalizzata che può essere anche preventiva. Ad esempio eseguendo il test per i geni BRCA1 e BRCA2 (attualmente si fa riferimento ad un pool di geni) è necessario preparare il paziente attraverso un incontro con un genetista medico che innanzitutto deciderà di prescrivere il test ed in seguito spiegherà al paziente a cosa va incontro. Dopo il test ci sarà una consulenza post-genetica, una consulenza durante la quale il genetista e uno psicologo spiegherà al paziente cosa vuol dire avere quel tipo di risultato, i geni mutati BRCA1 e 2 indicano una predisposizione verso il tumore della mammella, un maggior rischio di svilupparlo rispetto alla popolazione controllo costituita dalle altre donne. Inoltre corrisponde alla possibilità di trasmettere la mutazione di quei geni alla prole, che dunque può essere avvisata su questo fronte per poter effettuare lo screening ed avere la prontezza di seguire una terapia di prevenzione della patologia (Medicina Preventiva e Predittiva). Il test genetico per il tumore alla mammella e alle ovaie (condividono questi geni) ci consentono di fare predizione, determinate mutazioni in uno dei due geni possono dare indicazioni per l'uso di un tipo di terapia contro il tumore all'ovaio. Esempio della Jolie che ha eseguito la mastectomia bilaterale in seguito al test genico per BRCA e alla presenza di familiarità per quel determinato tipo di tumore, ovvero il tumore alla mammella. La medicina predittiva dunque ti permette di scegliere di procedere con la rimozione degli organi bersaglio. La medicina personalizzata è ormai un ambito abbastanza attuale da tempi recenti. Una tecnologia nota nel campo oncologico riguarda i microarrays. Esistono diversi test che riguardano i meccanismi cellulare che fanno riferimento a: • Trascrittoma, tutti gli RNA • Mirnoma, solo i micro RNA Oltre al sequenziamento diretto del DNA esiste l'NGS,ovvero il sequenziamento di tutti gli acidi nucleici. Parallelamente possiamo procedere con lo studio dei microarrays, studio contemporaneo di interi Esomi, di interi cDNA il principio lo abbiamo già visto parlando di screening di librerie e ibridazione di acidi nucleici. Noi possiamo immaginare una libreria di colonie batteriche, più cellule identiche. Lisiamo una di queste ed estraiamo tutto il suo RNA, lo separiamo prendendo mRNA lo retrotrascriviamo in cDNA e lo studiamo, lo posso studiare con il sequenziamento oppure con la tecnica dei microarray. I microarray di DNA sono anche conosciuti come gene chip, biochip.
Leggendo lavori importanti leggeremo di chip e macroarray, una tecnologia avanzata basata sul principio dell'ibridazione. La capacità che ha una singola elica di DNA di un acido nucleico di ibridare con un'altra emielica (sonda, catena oligonucleotidica marcata) complementare, noi produciamo le sonde per ciascuna molecola di cDNA e li fissiamo ad una superficie solida come plastica, vetro, silicio che formano una matrice. Questa matrice con sonde la metterò a contatto con altre molecole di cDNA trattate con fluorocromi differenti e attraverso ibridazione formerò molecole complementari (cDNA denaturato + sonde) e andrò a visualizzare attraverso scansione delle colorazioni, punti in cui sono state "spottati" le sonde (scanning e data analysis) tutti i punti in cui le molecole di cDNA hanno reagito con le sonde e normalmente ho tre colori: rosso, verde e combinazione. Attraverso la strumentazione dei microarray nel 2002 insieme ad un gruppo che lavorava sul sequenziamento del genoma umano abbiamo fatto uno screening delle librerie e abbiamo utilizzato la tecnica RDA (Analisi Differenziata di Retrotrascrizione), ovvero un primo approccio non robotizzato alla tecnica del microarray che ha diverse applicazioni. In questo caso consideriamo la più "antica". I microarray sono spesso utilizzati in diagnostica e rappresentano un'alternativa all'NGS e spesso vengono applicati per fare uno studio di comparazione di espressione genica, più immediato rispetto all'NGS, tra cellule tumorali e cellule normali. I microarrays hanno peculiarità diverse rispetto all'NGS, comunque sono tutte tecniche molto costose Questo è possibile tutte le volte che vogliamo studiare un'espressione genica e identificare dei geni coinvolti in una patologia, essendo il cancro una patologia multifattoriale si presta bene. Presenta fattori esterni e molteplici geni coinvolti, spesso alcuni geni non dovrebbero essere espressi e vengono attivati, altri che dovrebbero essere espressi vengono silenziati. Mettendo a confronto una cellula cancerogena estratta tramite biopsia e una cellula normale io posso immaginare il microarray come una sorta di possibilità di "fotografare" il trascrittoma delle due cellule e metterle a confronto verificando quali sono i geni in comune (che vanno esclusi) e quali sono i geni che invece caratterizzano la cellula tumorale rispetto alla cellula normale. Parlando di espressione genica ci riferiamo a RNA, proteine, varie possibilità di regolare l'espressione e vari geni (affrontati in relazione all'epigenetica) silenziati in certi tessuti e attivi in altri. Ci sono altri geni spenti in una cellula normale mentre ne sono accesi altri. La cellula tumorale si è "sdifferenziata", è tornata indietro diventando totipotente ed ha attivi tutta una serie di geni che normalmente non dovrebbero esserlo (codificano per fattori di crescita e tutta una serie di proteine che non dovrebbero esserci) oppure proteine della famiglia degli oncosoppressori che non funzionano, protooncogeni attivati in oncogeni. Una tecnologia come questa ci permette di avere un'idea sul profilo di espressione di una cellula tumorale rispetto ad una cellula sana. Partendo da una biopsia tumorale, isolando le cellule e mettendole in un mezzo di coltura, la cellula espiantata dal suo tessuto e posta in nutrimenti corretti, fattori di crescita, amminoacidi e glucosio, è in grado di crescere e riprodursi come se fosse un organismo unicellulare. Una cellula cancerogena in coltura è una cellula totipotente che prolifera in maniera continua senza inibizione da contatto. Le cellule tissutali normali poste in coltura primaria hanno un periodo di vita molto limitato, sufficente per noi per poter fare un confronto. Lisando le cellule ed effettuando i lavaggi con PBS e la centrifuga che consente di allontanare il materiale pesante e trattengo il trascrittoma (RNA) bloccando mRNA in cube con oligoDT sfruttando la coda di poliA. Raccolto il mRNA di cellule sane e tumorali, lo converto in cDNA marcati, tramite retrotrascizione e marcatura con due fluorocromi differenti, se colpiti da laser uno diventa verde (cellula sana) e uno rosso (cellula tumorale). In pratica io denaturo queste due molecole e a differenza di NGD (dove dovrei lavorare su linee differenti) metto insieme questi due pool di cDNA a singola elica a contatto con le sonde. Alcune sonde ibridizeranno con cDNA verde e altre con cDNA rosso, alcune possono ibridizzare con entrambe
dando come risultato un altro colore, ovvero il giallo. Questa immagine che avremo con gli spot colorati diversamente e con intensità differente. In giallo vedremo i cDNA di geni espressi in entrambe le cellule (principalmente costitutivi), in verde vedremo i geni espressi nella cellula sana, in rosso vedremo i geni espressi esclusivamente nella cellula cancerogena. Questo lo si può fare confrontando molteplici tipi di cellule. Se avessi voluto procedere con NGS avrei dovuto considerare il trascrittoma della linea cellulare sana e il trascrittoma della linea cellulare tumorale, e in seguito andare a studiare confrontando in modo più "indaginoso" le differenze nell'espressione genica delle due cellule. Le MAV sono malformazioni in cui manca un "letto" capillare tra la parte arteriolare e la parte che riguarda le venule, di fatto c'è anche qui una crescrita abnorme. Tra i geni che abbiamo considerato ci sono quelli dei fattori di crescita endoteliali. Questo tipo di tecnologia è applicabile a qualsiasi tipo di studio. Clonazione dei Mammiferi La clonazione è una tecnica che attualmente non riguarda solo il caso della pecora Dolly bensì interessa situazioni mediche come quella della PMA (Procreazione Medica Assistita). Al contempo è importante sapere che non si possono clonare gli organismi viventi, si possono clonare le cellule. In realtà il clone pecora Dolly non era considerabile tale perché erano fondamentalmente due organismi diversi. Soprattutto perché sono cresciuti in tempi diversi, si chiama clonazione per una ragione che è un motivo di fraintendimento. La produzione della pecora Dolly è stata possibile attraverso il trapianto di un genoma di una cellula somatica adulta in una cellula uovo non fecondata, che era stata privata a sua volta del materiale genetico. Da quella cellula è venuto fuori un organismo che è la pecora Dolly, e questo esperimento è stato denominato clonazione, in realtà non si può clonare un mammifero. Clonare una persona vuol dire originare un altro individuo identico nel momento stesso in cui la pratica viene effettuata. Il Gene Targeting Introdurre un gene modificato in un topo che ha produce una cellula staminale embrionale. Cosa è successo nella pecora Dolly? Abbiamo una cellula somatica adulta, che ha i suoi geni alcuni espressi alcuni silenziati. Da questa cellula viene prelevato il nucleo che viene trasferito in una cellula uovo non fecondata, questa ricevendo il nucleo forma un embrione, questo viene impiantato in una madre adottiva che produrrà la progenie, che saranno dei cloni di questo individuo (da cui è stato estratto il genoma cellulare). Questo procedimento viene reso possibile da uno strumento detto "micromanipolatore" che permette di estrarre il nucleo di una cellula somatica e trasferirlo su una cellula uovo. (segue video dimostrativo del micromanipolatore) Domanda "Nella clonazione è importante considerare il tempo di sviluppo e i fattori ambientali?" Risposta: "Certo, oggi abbiamo la possibilità di portare indietro le nostre cellulle con i terreni di coltura che ci permettono di utilizzare queste cellule, in passato era necessario lavorare con cellule uovo e dunque con l'embrione per manipolare le cellule. Oggi si fanno regredire le cellule adulte a cellule staminali." Lavorando sulle prime fasi embrionali sorgevano dei problemi anche di carattere etico. Oggi si parla di organoidi, a partire da cellule adulte poste in terreno di coltura noteremo una stimolazione dello sviluppo della cellula a generare un tessuto piuttosto che un altro. Dunque si formano proprio degli organoidi. LA PMA utilizza la fecondazione in vitro, senza queste conoscenze non saremmo arrivati a questo tipo di terapie. Il Gene Targeting e il DNA ricombinante ci consente di utilizzare animali transgenici per la produzione di farmaci, in questo caso si vedono dei bioreattori, strumenti impegnativi dove è possibile far crescere flora batterica inserendo il substrato corretto e produrre biomassa.
Con l'avvento del DNA ricombinante è stato possibile progettare dei bioreattori animali, è stato sfruttato l'animale per produrre una certa sostanza farmacologica nel liquido che ci è permesso isolare ovvero il latte. L'Interleuchina è stata prodotta così. Si combinano queste tecnologie che abbiamo detto, la prima cosa che dobbiamo fare è sintetizzare una molecola di DNA ricombinante e un vettore di espressione in cui abbiamo il gene umano che codifica per l'interloquina. A monte del gene viene ligato un promotore della proteina del latte che inganna la cellula della ghiandola mammaria. Quando il vettore viene trapiantato in una cellula uovo l'organismo cresce ed il vettore con il promotore della betagalattoglobulina sarà riconosciuto dall'RNA polimerasi della ghiandola mammaria, dove saranno attivati i fattori di trascrizione che procederanno con la sintesi della proteina che non sarà la galattoglobulina ma sarà il gene per l'interleuchina. Questo vettore consentirà di produrre una grande quantità di interleuchina a livello del latte, raccogliendo il latte abbiamo prodotto una certa quantità di interleuchina che una volta purificata sarà disponibile. Il bioreattore sarà dunque l'animale stesso che attraverso questo trasferimento di DNA ricombinante e l'impianto di una cellula uovo in una madre "adottiva" produce tutto questo. TERAPIA GENICA E DOPING Nel doping per migliorare le prestazioni o il recupero di un atleta è possibile utilizzare una terapia genica. A partire dalle conoscenze delle patologie neuromuscolari è stato prodotto un gene sintetico in grado, una volta impiantato, di far produrre una grossa quantità di eritropoietina. Un farmaco anche utilizzato in ambito oncologico per ristabilire i valori di cellule proliferative ematopoietiche stimolando la produzione di globuli rossi in seguito a chemioterapia. Ci sono molti geni oggetto di doping, tra i geni correlati alla resistenza c'è l'eritropoietina che normalmente viene prodotta dal rene ed agisce al livello del midollo osseo e consente di produrre globuli rossi in seguito a cicli di chemioterapici in pazienti oncologici. La consegna genetica di Eritropoietina è stata utilizzata in diversi studi sperimentali utilizzando come vettori degli Adenovirus. Molti virus vengono modificati per essere utilizzati come vettori. Un adenovirus è stato utilizzato per veicolare il gene codificante per la proteina SPIKE, che il coronavirus utilizza per entrare nelle cellule attraverso il recettore ACE. Il vaccino a mRNA viene veicolato attraverso una molecola lipidica che si fonde con la membrana e l'mRNA viene tradotto in SPIKE. Prelevando le cellule dall'organismo possono essere modificate per impiantare il gene e in seguito essere reinseriti nell'organismo del soggetto. La terapia genica può essere veicolata sistematicamente, come per la CID si può utilizzare prelevando le cellule dall'organismo e manipolandole, come per l'ata deaminasi si utilizzano i linfociti, i leucociti si mettono in coltura si manipolano, vengono trasfettati con il vettore che mi trasporta come gene l'ata deaminasi che è wild type funzionante, poi si infondono questri leucociti nuovamente nel paziente e per tutta l'emivita producono l'enzima. Recentemente si è iniziato a lavorare sugli elementi ematopoietici prima della maturazione, quindi direttamente sul midollo osseo che produrrà sempre cellule modificate. Il fattore di crescita vascolare viene iniettato in sede, senza manipolazione cellulare esterna né somministrazione sistemica. Questo fattore aumenta la vascolarizzazione e la crescita muscolare. Facendo riferimento all'immagine del bue a cui è stato somministrato il gene della miostatina mutato, è stata rintracciata in natura la presenza di questo gene mutato che induce super crescita. La miostatina appartiene alla famiglia dei fattori di crescita di tipo beta ed è responsabile del differenziamento dei muscoli scheletrici. La mutazione del gene codificante miostatina provoca una enorme crescita dei muscoli perché essendo un inibitore della crescita se non viene codificato la crescita risulterà sproporzionata. Modelli Animali KNOCKOUT Normalmente quando si vanno a studiare i geni, oggi abbiamo una tecnologia estremamente innovativa che è il CRISPR CAS, si usano i topi KNOCKOUT. Dei modelli animali per studiare una malattia.