Title Biologia Lezione 37.pdf ✅

1. Rispetto alla slide precedente, facciamo finta che il vettore sia un vettore di clonaggio, all’interno del quale abbiamo inserito il nostro DNA d’interesse (che può anche essere il cDNA, lo stesso di prima, ma stavolta si vuole studiare il DNA) 2. I batteri vengono trasformati; 3. Ci sarà insieme di colonie; si prende, singolarmente, ognuna di esse e la si mette in mini- coltura, in ciascun pozzetto del microtiter; 4. Si dispongono, in maniera ordinata, su una coltura (sempre su Agar); poi si posiziona il filtro di nitrocellulosa; 5. A livello del filtro di nitrocellulosa si provocherà la lisi delle cellule; si elimina l’eccesso e si denaturano le molecole di DNA; 6. Una volta denaturate le molecole di DNA, ancora fissate, si mettono in sospensione con una sonda la quale è diretta contro il cDNA; 7. Il punto nel quale si lega e riconosce l’emielica complementare sarà il punto in cui avremo la nostra colonia; Quindi, questo è uno screening di librerie che si fa mediante ibridazione e uso di sonde. La tecnica della quale ci occuperemo oggi è una tecnica che, come la PCR, esiste da parecchio tempo, ma viene ancora utilizzata oggi. Si tratta del sequenziamento diretto del DNA, attraverso il quale si riesce a conoscere l’esatto ordine dei nucleotidi in un frammento di DNA. Se, ad esempio, prendiamo sempre in considerazione un frammento di 800 bp, dopo il sequenziamento si otterrà una sequenza di nucleotidi e si saprà esattamente qual è l’ordine dei nucleotidi, cioè l’esatta sequenza.
Quindi, alla domanda: cosa permette di fare il sequenziamento? La risposta è: il sequenziamento consente di conoscere l’esatto ordine con cui sono presenti i nucleotidi all’interno di un frammento di DNA. Oggi si parla di sequenziamento a tanti livelli. Abbiamo la next generation anche per il sequenziamento, che si chiama next generation sequencing (NGS). L’NGS è un sistema che ci consente di sequenziare l’intero genoma di un individuo, conoscere esattamente la sequenza e l’ordine dei miliardi di nucleotidi presenti in un individuo. Siamo nell’epoca dei big data, delle omix, dove con omix s’intendono proprio questi big data. Tutte le omiche sono le discipline, o le branche, della biologia cellulare, della biochimica, in cui si studia l’intero assetto di una cellula. Se si parla di genomica, quindi genomix, s’intende il sequenziamento dell’intero genoma di una cellula. Se si parla di trascrittoma, quindi transcriptomics, si intende il sequenziamento di tutti gli RNA presenti in una cellula in quel dato momento. Per cui, se tra questi RNA si selezionano solo i miRNA, si può studiare il miRNoma. Si può anche studiare l’interattoma, ovvero tutte le molecole che interagiscono tra loro, le proteine dei pathways. C’è anche la metabolomica, ovvero lo studio di tutti i metaboliti nella cellula. Oggi si studia tanto l’esoma, l’esatta sequenza di tutta la sequenza codificante della cellula. Quando si dice “sto studiando l’esoma di quel paziente” s’intende che dalla cellula del paziente viene estratto l’mRNA, la sequenza codificante, che viene retro-trascritto in cDNA, il quale viene sequenziato per intero. In questo modo si avrà tutta la sequenza codificante dell’intera cellula. Che informazioni può dare l’esoma? Quelle che si ottenevano con la libreria di cDNA, ma in maniera più veloce: tutte le sequenze codificanti. In diagnostica si studia, con la tecnica chiamata Metodo Sanger e con il sequenziamento diretto, il sequenziamento dell’esoma e non del frammento. La differenza è che con il sequenziamento diretto si può sequenziare un frammento di massimo 1000 bp. Quindi, quando si aveva un gene di 10.000 bp, prima che esistesse l’NGS, per poterlo sequenziare si dovevano fare tantissime sequenze. Inoltre, ci sono molte malattie genetiche che non sono di tipo mendeliano, ma sono multigeniche. “Multigeniche” significa che la causa della malattia, legata a un danno del DNA, è da ricercare in più geni (3, 4, 10, 20), quindi dipende dal tipo di malattia. Inoltre, nelle malattie multigeniche, se si ricerca la mutazione causativa della malattia, e si sa che i geni implicati possono essere tantissimi, sequenziare tutti i geni è un lavoraccio (anche se viene fatta una sorta di cernita). Ecco che viene in aiuto, per esempio, l’esoma. Con l’esoma, in realtà, il ricercatore vede solo la sequenza codificante, ma di tutti i geni. Per cui, se si sa già quali sono i geni coinvolti, anche se ci sono 100.000 bp, si sa già che si potranno sequenziare in un’unica soluzione, studiando l’esoma in NGS. Però, se fatto a fini diagnostici, questo non è sufficiente: bisogna andare a cercare le stesse mutazioni trovate nei geni noti, quelli nei quali viene ricercata la mutazione, noti per essere causativi, nei due genitori. In questo caso si parla di esoma clinico. Questa è, da diversi anni, una realtà. Oggi, sempre di più, si studia l’esoma clinico perché per trovare le stesse informazioni sugli stessi geni bisognerebbe lavorare molto di più. Chiaramente, quando si fa l’esoma, il software non restituisce i dati chiari e di facile comprensione facendoci capire subito dove sono collocate le mutazioni; è vero che ci sono dei pannelli, anch’essi utilizzati in diagnostica, che sono più semplici; ma, in generale, quando si studia l’esoma di un paziente affetto da una malattia genetica rara, specialmente quando della malattia studiata non si sa nulla, si ha l’abitudine di analizzare i vari dati, analisi informativa che è molto lunga, che prevede un work flow preciso di lavoro. È un lavoro in cui si intersecano: la bioinformatica, la statistica applicata alla biologia, molta genetica... è il ricercatore che sceglie, tra milioni di dati (per questo si parla di big data), quelli che sono più utili e congrui alla ricerca e alla malattia. Però, è chiaro che questo tipo di tecnologia, l’NGS, è molto utile. Ciononostante, proprio perché ti dà tantissimi dati, che sono il risultato di un’analisi anche statistica, non si può paragonare al sequenziamento diretto, nel senso che non ti dà la realtà dei fatti: ti dice che, statisticamente, ci sono queste varianti. Di solito, ed è obbligatorio, non è che quando si selezionano, dallo studio di un esoma, 40 varianti quelle siano sicuramente delle varianti genetiche. A questo punto, una volta isolate, il lavoro che si deve fare è quello di disegnare dei primer in modo da poter amplificare e sequenziare, con il sequenziamento