Content text L'IMMUNOLOGUE - MINI
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3 1. Introduction • La réaction Ac-Ag peut être utilisé pour chercher des molécules spécifiques, sauf que c’est une réaction invisible, d’où l’intérêt de l’immunomarquage. • Nous connaissons 4 techniques d’immunomarquage : - Technique d’immunofluorescence (IF) : utilisant un fluorochrome - Technique immunoenzymatique (ELISA) : utilisant une enzyme - Technique radio-immunologique (RIA) : utilisant un radio-isotope - Technique de chimiluminescence (CLIA) : utilisant un chimiluminescent • Affinité : force de liaison entre un épitope et un paratope (un seul site de liaison de l’Ac) • Avidité : force de liaison globale de l’antigène avec plusieurs Ac, chacun étant spécifique d’un épitope unique sur cet Ag • L’avidité est supérieure à la somme des affinité différentes Il existe des techniques par compétition, et des techniques Sandwich (seront expliquées plus tard) 2. Immunofluorescence • Principe : un Ac marqué se lie à la cible, et sera vu au MO grâce à la fluorescence du marqueur. 2.1. Immunofluorescence directe (IFD) • L’Ac marqué reconnaît directement l’Ag qui lui est spécifique (puis lecture au MO à fluorescence) • L’IFD à double marquage est très utilisée en oncologie 2.2. Immunofluorescence indirecte (IFI) • L’Ac marqué ne reconnaît pas directement l’Ag ; un autre Ac se lie à l’Ag, puis l’Ac marqué se lie au complexe Ac-Ag formé • Exemple : recherche des anticorps anti-nucléaires AAN - Aspect homogène : l’Ac reconnait tout le noyau - Aspect moucheté : l’Ac reconnait les Sn-RNP - Aspect nucléolaire : l’Ac reconnait le nucléole - Aspect centromérique : l’Ac reconnait le centromère • Titre des Ac : l’inverse de la dernière dilution qui donne un résultat positif (présence d’Ac dans le sérum). Un titre de 80 est utilisé comme seuil (plus c’est élevé plus c’est grave) 3. Techniques immunoenzymatiques et radio-immunologiques Techniques similaires, aboutissant au même résultat (selon qu’il soit par compétition ou par Sandwich) • Technique immunoenzymatique (ELISA) : principe de la réaction Ac-Ag couplée à une réaction enzymatique amplifiant le signal - Méthode : l’Ac est conjuguée à une enzyme. Après incubation (Ac-Ag) et lavage, un substrat est ajouté. Si l’Ac y est toujours (par formation du complexe Ac-Ag, preuve de présence de l’Ag recherchée) il y’aura réaction enzymatique (enzyme conjuguée à l’Ac – substrat ajoutée) et libération d’un produit détectable. • Technique radio-immunologique : principe de la réaction Ac-Ag, mais l’Ac est conjugué à un isotope radioactif. - Nous notons 2 techniques : RIA qui marque l’Ag cible (technique par compétition), et la IRMA qui marque l’Ac (technique Sandwich) 4. Chimiluminescence Imuno Assay (CLIA) C’est une technique qui repose sur le fait que certaines molécules, à l’état d’excitation lors d’une réaction, émettent une lumière 5. Technique par compétition Cette technique est couplée soit à l’ELISA soit à la RIA • Une compétition est établie entre les molécules marquées (industrielles) et non marquées (du sérum) • Résultat : signal inversement proportionnel - Si concentration basse de l’Ag sérique → fluorescence élevée / concentration élevée de l’Ag sérique → fluorescence basse Techniques d’immunomarquage