Title Clase 3-Identificación bacteriana.pdf ✅

~ 1 ~ Alternativas metodológicas en la identificación bacteriana 1. Aislar el microorganismo causal del proceso infeccioso. 2. Conocer su patrón de sensibilidad a los antimicrobianos. 3. Generar los datos que permitan definir el escenario epidemiológico de la institución. Se reciben muestras clínicas (muestra de cualquier fluido corporal o cualquier tejido que puede ser sangre, materia fecal, orina, etc. Que se le extrae al paciente para buscar el microorganismo que esta causando un proceso infeccioso). Por otro lado, no solo alcanza con saber el nombre del microorganismo, también se debe conocer su patrón de sensibilidad antimicrobiano. Por último, generar los datos que permitan definir el escenario epidemiológico (frecuencia con la que aparecen determinado agentes etiológicos de las distintas infecciones) de la institución. Todo esto se realiza para diseñar estrategias de tratamientos empíricas hasta tener los datos certeros de la sensibilidad antimicrobiano para tratar al paciente con antibióticos. Una vez que llega la muestra clínica al laboratorio se realiza un procesamiento de la misma para tratar de aislar el agente etiológico del proceso infeccioso. Primero se realizan extendidos de esa muestra, es decir, distribuir una porción de esa muestra sobre un portaobjeto, para que luego de su secado se someta a distintas coloraciones para poder visualizar la presencia de gérmenes. Luego se visualiza microscópicamente la presencia de gérmenes, que se realiza con la tinción de Gram (base de clasificación clínica mas importante). Esta tinción nos permite ver el tipo (+ o -) y la morfología de la bacteria. Existen bacterias que no se colorean con esta tinción, como son las micobacterias También se siembra a la muestra con un anza en una placa con medio de cultivo, por ejemplo, medios de cultivos que le aporten nutrientes a las bacterias posibles en esa muestra o medios de cultivos diferenciales que permiten ver diferencias entre algunas bacterias. Identificación bacteriana
~ 2 ~ Medio cromogénico: medio de cultivo que tiene incorporado una cantidad de sustrato determina y que cuando la bacteria los utiliza, ya que tiene las enzimas necesarias para metabolizar ese sustrato, van a dar una coloración particular en la placa. Las diferentes coloraciones se darán dependiendo si la bacteria pudo o no utilizar el sustrato. Después de esto, la placa se coloca en una estufa hasta 37° entre 18 y 24 hs, y luego se ve que las bacterias crecen, es decir, el tiempo estimado de crecimiento de esa bacteria. Un caso particular de muestras que definen la sepsis, son las muestras de sangre se siembren en frascos de hemocultivo y se incuban en incubadores que pueden detectar el crecimiento bacteriano de una forma automatizada. Cuando la bacteria empieza a crecer produce CO2 que impacta en una sustancia que tiene el frasco en el fondo, produciendo una reacción de cambio de color de esa sustancia, y es detectada por el incubador. Con estas pruebas bioquímicas se llega a la mayor parte de genero y especie de las bacterias que producen infecciones clínicas. Como primera instancia se utiliza para hacer el Gram directo de la muestra que nos permite informarle presuntivamente al médico los agentes etiológicos de alto impacto clínico. Tratamiento empírico: es aquel que se instaura antes de tener los resultados definitivos bacteriológicos. No para todas las muestras ni para todos los focos infecciones la tinción de Gram tiene la misma rentabilidad. Rentabilidad de una prueba: es la capacidad que tiene esa prueba de informarnos o de darnos datos objetivos de la presencia de un microorganismo. Por otro lado, nosotros contamos con sitios anatómicos completamente estériles, es decir, que no presentan normalmente bacterias, y con sitios anatómicas normalmente colonizados, que son aquellos que tienen una microbiota propia. Los normalmente colonizados en general la observación microscópica no tiene mucha rentabilidad. Esta tinción permite evaluar concordancia entre lo observado en la muestra original y lo que yo rescato en el cultivo, es decir, se compara si aquellos morfotipos que vimos en el examen directo son los que se recuperan en el medio de cultivo. Si alguno de ellos no lo recupero posiblemente se deba a que ese medio de cultivo no es apropiado para la recuperación de esa bacteria. Por ejemplo, si yo encierro a mis bacterias en una atmosfera de oxígeno, ambiental, seguramente las bacterias anaerobias estrictas no crecerán. Por otro lado, la coloración de Gram nos sirve para hacer grande las colonias aisladas de los medios de cultivos sólidos, siendo el punto inicial de la identificación bacteriana tradicional. Colonia: es el crecimiento, la reproducción o punto de partida de una bacteria que quedo en la placa, en muchas bacterias que van formando una colonia. Esta se debe encontrar bien aislada para hacer la identificación, ya que si hay mezcla de dos tipos de bacterias no se podrá identificar. Además, la coloración de Gram de los hemocultivos, una vez que el aparato nos indica que son positivos nos proporciona una información muy importante del agente que puede estar
~ 3 ~ involucrado en la bacteria. También permite conocer a las bacterias en el desarrollo de un medio liquido a fin de seleccionar que medio solido puedo usar para el re-aislamiento de la bacteria. Tubos con caldo: medio de cultivo líquido, que nos permite obtener un gran numero de bacterias desde una. Sin embargo, en un sólido, van a crecer tantas colonias como bacterias haya puesto en la placa. Para que crezcan bacterias en una placa, la concentración de bacterias que debe haber en la muestra original debe rondar como mínimo 100 bacterias x ml. Por último, nos permite confirmar la genoespecie ante la aparición de perfiles de resistencia inusual. Ya tenemos la colonia aislada, de la bacteria, agente etiológico. Situación: estamos frente a una infección monomicrobiana de un foco determinado. Nos encontramos frente a una meningitis producida por un estafilococo (Gram +, que se agrupa en racimos) en el espacio meníngeo. Tenemos una muestra de liquido cefalorraquídeo luego de una punción lumbar, la sembramos en un medio de cultivo y al día siguiente en la placa crecieron un solo tipo de colonia. Un morfotipo colonial característico. Tomo de esa colonia con un anza, una diferente a la que utilice para sembrar, y realizo una prueba de identificación. Tipos de pruebas Tienen que ver con el avance tecnológico que ha sufrido el laboratorio en los últimos 30 años. Métodos fenotípicos tradicionales Nos muestran aquello que se expresa del genoma bacteriano. En el genoma bacteriano se encuentra codificada la información para todas las proteínas que va a tener una célula. Estas proteínas, gran parte de ellas, van a tener una funcionalidad enzimática, serán catalizadores biológicos, por ende, disminuyen el tiempo con que ocurren las reacciones metabólicas. Todo proceso metabólico de una bacteria o de una célula eucariota requiere de la presencia de enzimas. Por lo tanto, la fenotipia es la expresión de esa información genética que esta en el genoma para la producción de aquellas enzimas que puedan mediar determinados procesos metabólicos. Para esto, ponemos en un medio de cultivo el sustrato que nos interesa ver si la bacteria lo puede utilizar a través de una ruta metabólica, porque tiene las enzimas correspondientes, y trato de idear un sistema que me permita generalmente a través de un cambio de coloración de la bacteria en ese medio de cultivo ejemplificar que la bacteria pudo usar ese sustrato Por ende, en general los medios de cultivos que se utilizan para hacer las pruebas bioquímicas son de alguna manera medios de cultivos diferenciales y mayormente tienen restringido sustratos de forma tal que para que se vea un cambio de color la bacteria debería haber tenido las enzimas para utilizar el sustrato agregado en el medio de cultivo. Si la bacteria no tuviera las enzimas, no puede crecer debido a que la cantidad de sustratos están en una concentración tan pequeña que no hacen otra cosa que permitir que se pueda desarrollar el ciclo metabólico de interés. Por otro lado, vemos la morfología (forma, tamaño, hemolisis, pigmentación, textura) colonial de la placa inicial donde se sembró la muestra. Nos ayuda porque hay una amplia descripción de las bacterias que producen patología.
~ 4 ~ Las pruebas bioquímicas son aquellas que se realizan en medios particulares donde tenemos generalmente un sustrato en cada medio, por lo que, podremos observar las características metabólicas. Por ultima esta prueba nos permite evaluar la sensibilidad antimicrobiana. Sistema fenotípicos semiautomatizados Permiten probar gran cantidad de sustratos (10-50) simultáneamente. Permite generalmente interpretar con sistema de códigos numéricos, que luego se puede ingresar en una base de datos dándome la identificación de la bacteria en cuestión. Incluso algunos pueden ser de lectura rápida, que se revelan a las 4 horas. Sistemas fenotípicos totalmente automatizados Utilizan sustratos liofilizados (deshidratados) en diferentes soportes que pueden ser tarjetas, policubetas, galerías, pero en vez de leerlas manualmente y asignarles un número, se incuban en un aparato que lee el revelado y permite hacer la prueba de sensibilidad de los antibióticos. Además, la resolución del código es automática e informatizada. Los métodos fenotípicos identifican a la bacteria a través de la presencia o no de determinadas enzimas que son la expresión de genes que están codificados en el genoma bacteriano. Métodos genotípicos Son métodos que observan el ADN cromosomal o el ARN ribosomal. El mas difundido para las bacterias es la secuenciación del ARN ribosomal 16s. En la actualidad la base de secuencias alcanza 10.000 bacterias. Permite además establecer relaciones filogenéticas entre las bacterias. Se han utilizado también las secuencias de ARN 23s, otra secuencia utilizada en la actualidad es la de la subunidad B del gen ropB, que es un gen que tienen casi todas las bacterias. La subunidad B de ese gen es muy variable entre una especie bacteriana y otra, por lo cual permite, cuando se sabe la secuencia de esa subunidad, saber de que bacteria se trata. Sistemas proteómicos Son sistemas que leen o que estudian las proteínas que sintetiza una bacteria (proteoma bacteriano). Se fijan las proteínas ribosómicas, los ribosomas están compuestos por ácidos nucleicos y proteínas, estas proteínas son muy características y diferentes entre una especie bacteriana y otra. Utiliza la metodología de espectroscopia de masa, que es la obtención de un espectro graficado de los picos que me da esa bacteria con respecto a las proteínas que tiene. A medida que se incrementa su utilización mundial también lo hace la base de datos incorporada. Es un método genotípico. Constituye unas de las técnicas de análisis genético mas moderna y tiene como finalidad generar millones de copias de un segmento de ADN en particular. Esto se realiza para tener una cantidad significativa de muestra biológica, con la cual trabajar. La PCR básica requiere de 4 componentes: