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interesse. Questa si chiama libreria genomica ed è una collezione di cloni batterici contenenti ciascuno un frammento di DNA appartenente a un genoma di partenza. (la prof ha spiegato solo queste due modalità) C’è una tecnica utilizzata un po’ da tutti i laboratori che si occupano di DNA, che sia applicata alla genetica, che sia utilizzata in farmacogenetica, in farmacologia, in biologia molecolare o in biochimica molecolare ovunque si utilizzi DNA in qualsiasi laboratorio è necessario, è presente uno strumento che si chiama termociclatore. Il termociclatore è uno strumento che ci consente di portare avanti una tecnica chiamata PCR. La PCR detta anche ‘amplificazione’ (polymerase chain reaction = reazione a catena della polimerasi) è una tecnica che fondamentalmente è come se facesse delle copie del DNA, un po’ come abbiamo fatto col clonaggio. A differenza del clonaggio nella PCR non usiamo le cellule, non conserviamo alla fine del processo una collezione di cloni ma conserveremo frammenti di DNA che in qualche modo abbiamo copiato, replicato, amplificato nel termociclatore. La PCR prevede una serie di passaggi, numerosi cicli e ciascun ciclo è costituto da diversi step. In particolar modo osserveremo la crescita delle copie di DNA in 2 ore e mezza (il tempo che impiega una normale PCR è 2 ore / 2 ore e mezza, massimo 3 ore). Abbiamo sentito parlare di PCR, sappiamo che esiste una tecnica che ci consente di fare lo screening molecolare chiamato test molecolare che è un test che utilizza una variante della PCR. Questa variante è l’RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction = reazione a catena della polimerasi inversa). La PCR impiega 2 ore e mezza (un test molecolare richiede fondamentalmente 3 ore) e viene utilizzata normalmente per identificare la presenza del gene codificante la spike che andiamo a cercare. La spike è quel recettore, quella proteina recettoriale che sporge dal virus, dall’involucro presente all’esterno del virus del SARS 19 e che riconosce il recettore ACE e lo lega per entrare all’interno della cellula. La spike come tutte le proteine è codificata da un gene. Quando si va a fare il test molecolare, si intende proprio andare ad amplificare i frammenti del DNA ma in realtà vedremo che c’è un RT-PCR, una variante della PCR, che consiste nella sintesi di una molecola di DNA a doppio filamento a partire da uno stampo di RNA. La molecola di DNA sintetizzata mediante il processo di retrotrascrizione è definita cDNA. Però alla fine è sempre il DNA che è codificante per questa spike anche se il virus è un virus a RNA. La PCR in 2 ore e mezza / 3 ore è una tecnica che consente, partendo da una molecola, di produrre milioni di molecole. La crescita è esponenziale. Da una molecola se ne formano due, da due se ne formano quattro, da quattro se ne formano otto e così via. In poche ore abbiamo una collezione enorme di frammenti di DNA. Nella PCR tube o provetta eppendorf avremo solo frammenti di DNA che abbiamo amplificato. Amplificazione del DNA mediante PCR
Su che cosa si basa questa tecnica? Se ricordiamo durante la prima lezione di questo argomento abbiamo fatto un po’ la cronistoria di quelli che sono stati i processi fondamentali che ci hanno consentito di sviluppare le tecnologie sul DNA ricombinante e tra queste abbiamo inserito anche una data che è il 1983. Questa è la data in cui Kary Mullis per questo vinse il premio Nobel, proprio per aver scoperto questa reazione della DNA polimerasi che sta alla base di questa tecnica che ha cambiato un po’ le nostre prospettive, tecnica ancora attualissima e molto utilizzata. Che cosa ha visto? Cosa ha messo in evidenza questo ricercatore? Ha messo in evidenza il fatto che noi possiamo replicare in qualche modo in vitro il DNA e sappiamo che durante il processo della replicazione del DNA abbiamo fondamentalmente un primer che viene sintetizzato da una primasi perchè la DNA polimerasi che poi estende questo primer non è in grado di sintetizzare il primo nucleotide. Per cui normalmente durante la replicazione del DNA abbiamo una primasi che sintetizza il primer e poi la DNA polimerasi che allunga il filamento che stiamo sintetizzando. Sappiamo che questo avviene in vivo e per avere due eliche stampo, parlando della replicazione del DNA, abbiamo la molecola del DNA che è super avvolta e la prima cosa che facciamo è svolgere le topoisomerasi e poi denaturare con l’elicasi così ciascuna emielica servirà da stampo per la sintesi della nuova emielica. Su ogni stampo in effetti avremo la sintesi di una nuova catena che crescerà in direzione 5’ – 3’ perché verrà sintetizzato un primer poi allungato. Abbiamo la presenza di diversi enzimi: topoisomerasi, elicasi, ligasi cioè abbiamo una macchina replicativa abbastanza complessa. La complessità è data dalle tre diverse RNA polimerasi. In provetta, il termociclatore funge da amplificatore. Il termociclatore è così chiamato perché ciclicamente mantiene la temperatura imposta dall’operatore, attraverso dei pulsanti impostiamo la temperatura che il termociclatore deve mantenere e introduciamo i nostri file, i nostri protocolli. All’interno del termociclatore mettiamo questo tipo di provetta eppendorf o PCR tube. Vengono anche messi nel termociclatore tutta una serie di reagenti indispensabili per favorire e per far sì che avvenga la PCR, questa reazione a catena della polimerasi. Normalmente nella cellula abbiamo una primasi, poi le DNA polimerasi che aggiungono nucleotidi presenti nel pool, i nucleosidi trifosfato che abbiamo liberi nel pool normale della cellula. Se volessimo simulare la replicazione del DNA, così come proposto da Kary Mullis, la cosa importante Termociclatore Provetta eppendorf
che dobbiamo riuscire a fare è denaturare il DNA per separare le due emieliche, prevedere dei primer che ci diano l’innesco, mettere una polimerasi che chiameremo Taq che allunga questo frammento/primer. Prendendo il DNA a doppia elica lo denaturiamo, la denaturazione nella cellula avviene a carico dell’elicasi. L’elicasi, con energia a spese di ATP, idrolizza i legami idrogeno. Nella provetta non abbiamo un’elicasi ma utilizziamo la temperatura. La prima fase della PCR si chiama denaturazione, denaturazione perché è quello step della PCR durante il quale la doppia elica viene separata nelle due emieliche del DNA. La prima fase della PCR (denaturazione del DNA) avviene a 95 gradi. Se portiamo il DNA a 95 gradi si denatura, riusciamo a idrolizzare tutti i legami idrogeno che tengono uniti l’adenina con la timina e la citosina con la guanina. Se abbiamo una molecola di DNA ricca in citosina e guanina e la mettiamo a confronto con una molecola di DNA della stessa lunghezza ricca in adenina e timina, per denaturare queste due molecole dobbiamo erogare la stessa energia? Abbiamo bisogno di più calore (aumentiamo il calore attraverso la temperatura)? Serve più calore per rompere i legami tra guanina e citosina. Domanda d’esame: Come faccio a scegliere la temperatura di annealing dei primer? La denaturazione avviene a 95 gradi ed è uno step che dobbiamo considerare come primo step iniziale. Allora la prima cosa da fare è portare il DNA a doppia elica alla temperatura a cui si denatura con la conseguente separazione delle due emieliche, questo avviene in provetta e gli diamo dei tempi. Il secondo step dev’essere l’annealing detto anche ‘appaiamento’ riferito ai primer. I primer sono quegli oligonucleotidi di 18-20 nucleotidi di numero di DNA questa volta, e non RNA come avviene nella cellula, che l’operatore disegna; ad esempio considerando nel gene di interesse la sua porzione centrale disegnerà una coppia di primer a un’estremità e l’altra coppia all’altra estremità. La DNA polimerasi utilizzata in PCR è la Taq polimerasi (DNA polimerasi termostabile che è una polimerasi proveniente dall'organismo termofilo Thermus aquaticus) che deriva da ceppi di batteri che vivono appunto ad alte temperature e quindi hanno saputo e sanno sopravvivere a temperature elevatissime che per noi sono incompatibili con la vita (95 gradi è quasi la temperatura di ebollizione dell’acqua). È normale che questo enzima, una proteina che funziona a 95 gradi, sia una proteina sicuramente diversa da quelle che compongono il nostro organismo. Noi siamo costituiti da proteine ma le nostre proteine rischiano problemi di denaturazione, di alterazione già quando superiamo i 37 gradi, 40/41 gradi quando abbiamo la febbre alta e infatti facciamo abbassare la febbre per evitare proprio questi problemi delle proteine. Invece la Taq polimerasi, derivando da questi batteri, pur essendo un enzima, una proteina funziona anzi funziona in maniera ottimale a 72 gradi e a 94 gradi non si denatura. Per cui possiamo inserire nella provetta eppendorf, insieme al DNA di partenza, la Taq polimerasi e successivamente aggiungiamo i primer e chiaramente i DNTP (o dNTP) i deossinucleosidi trifosfato perché la sintesi del DNA può essere fatta in vitro ma bisogna dargli gli elementi di base quindi i nucleotidi. Poi tutta questa miscela in presenza di magnesio, di un buffer (il buffer TBE è una soluzione tampone usata nella preparazione di gel elettroforetici di agarosio per la separazione di frammenti di DNA risultanti dall'amplificazione di PCR, da protocolli di purificazione e da esperimenti di clonaggio) portato a volume va messa all’interno del termociclatore e avviene la PCR. Ritorniamo ai primer e all’annealing. L’annealing è la seconda fase, il momento in cui i primer si appaiono con la sequenza complementare (G-C, A-T). L’operatore disegna i primer, li fa