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BIOLOGIA APPILACATA LEZIONE 36 14-05-2021 Prof. Sidoti ELETTROFORESI L’elettroforesi è una tecnica basata sul principio secondo cui se immergiamo una macromolecola carica in un campo elettrico ed eroghiamo corrente continua, la molecola si sposterà e migrerà verso il polo opposto. Una camera elettroforetica è un supporto collegato ad un alimentatore connesso alla corrennte elettrica su cui viene inserito un tampone (normalmente viene utilizzato il TBE Tris-borato-EDTA) . Questo buffer viene utilizzato anche per preparare il gel. Il gel viene preparato con un buffer che è lo stesso di quello inserito nella camera elettroforetica con l’aggiunta di agarosio. L’agarosio è un polimero che deriva dall’agar e a 55-65° si scioglie e se si fa raffreddare gelifica. Un gel di agarosio si prepara sciogliendo la concentrazione appropriata di agarosio in polvere in una soluzione tampone mediante ebollizione e versando la soluzione ottenuta in un apposito contenitore rettangolare piano. Prima che inizi la solidificazione della soluzione di agarosio a temperatura ambiente, ad una estremità del contenitore viene immerso un pettine in plexiglas che permette, in seguito alla solidificazione, di ottenere una serie di pozzetti dove verranno caricati i campioni di acido nucleico in soluzione con l’ausilio di puntale e pipetta. Il gel viene quindi trasferito in un apparato da elettroforesi, viene immerso nello stesso tampone utilizzato per la camera elettroforetica, vengono caricati i campioni e viene applicata la corrente ai due elettrodi per permettere la migrazione delle molecole di DNA (cariche negativamente) verso l’anodo (carico positivamente). Immaginiamo di aver amplificato un frammento, un gene di nostro interesse di 900 bp, poi un altro di 1100 bp e poi un altro. Qualsiasi che facciamo con il DNA, la prima cosa da fare è verificare su un supporto con gel quello che abbiamo fatto. Se mettessimo il DNA nel pozzetto lo perderemmo e non si vedrebbe.
Per questo i campioni di DNA da analizzare per gel elettroforesi sono diluiti in un tampone di caricamento appropriato detto tampone di corsa che ha due ruoli: 1. È colorante e quindi ci permette di vedere durante le migrazioni dove arriva il DNA. Si separa rispetto al DNA in maniera diversa quindi precede il DNA e attraverso il blu fa vedere dove arriva il DNA. 2. Aumenta la densità del campione di DNA quindi lo appesantisce facilitando il suo caricamento nei pozzetti. Così facendo quando il DNA viene depositato nel pozzetto e una volta che inseriamo la carica elettrica esso migra con una velocità che dipende dal frammento di DNA. Nell’immagine a fianco in blu vediamo il tampone di corsa che ci fa vedere esattamente dove è arrivato il DNA che invece è quello dietro, ogni corsia su cui migrano i diversi frammenti viene chiamata lane. Il DNA migra lungo il gel attraversando una sorta di trama. Più è concentrato il gel la gelificazione dà un gel ancora più denso e quindi il DNA migrerà più lentamente.se ho un gel all’1% il DNA migra con una certa velocità, se ho un gel al 3% (3 mg di gel in 100ml di tampone) il gel è più denso e quindi il DNA migra più lentamente. Questo serve quando vogliamo separare due frammenti che sono simili tra di loro. Se infatti vogliamo analizzare due frammenti diversi, uno di 100 nucleotidi e l’altro di 1000 nucleotidi non abbiamo problemi perché la velocità di migrazione sarà completamente diversa: quello di 100 bp sarà molto più veloce rispetto a quello di 1000 bp. Ma quando si vogliono analizzare due frammenti che differiscono l’uno dall’altro di pochi nucleotidi (fino a circa 50), per separarli meglio conviene utilizzare un gel molto denso (3-4%) e una corsa molto lenta. Questa è l’immagine che ci permette di vedere come avviene il caricamento con il loading buffer (tampone di caricamento), questi sono i puntali della pipetta. Normalmente dopo che i campioni vengono caricati i e viene connessa la camera all’alimentatore, poi il gel presenta dei frammenti e ad ogni lane si hanno due frammenti di lunghezza differente. Per confrontare il campione viene utilizzato il ladder, un marcatore a peso
molecolare noto, qualcosa di cui è nota la lunghezza per confrontare il campione e stabilire quale è quello corretto. Questa è l’immagine che vediamo nella realtà. L’apparecchio si chiama transilluminatore, quelli che si vedono sono gli ultra violetti. Perché vediamo il DNA in questo colore rosa/arancio? Quando abbiamo parlato delle mutazioni geniche, tra gli agenti mutageni chimici abbiamo visto il bromuro di etidio che è un intercalante delle basi. Esso si lega al DNA e se, nel momento in cui mettiamo a contatto l’etidio bromuro con il DNA, il DNA si sta replicando si intercala tra un nucleotide e un altro e questo durante un processo di sintesi del DNA può determinare una mutazione. Quando prepariamo il gel con l’intenzione di far migrare il DNA viene aggiunta una sostanza che è l’etidio bromuro anche se oggi questo colorante è meno utilizzato per l’elevata tossicità. Quando si aggiunge l’etidio bromuro, si mette all’aria, si fa raffreddare il gel e appena il DNA viene caricato nei pozzetti questo lega l’etidio bromuro e quando lo espongo agli ultravioletti questo emette una fluorescenza che indica esattamente dove è il DNA. Questo si può fare aggiungendo l’etidio bromuro durante la produzione del gel o si può preparare il gel e poi mettere l’etidio bromuro e farlo assorbire in un lavaggio per un po’ di tempo. Comunque sia quando vogliamo visualizzare un frammento di DNA lo facciamo normalmente con gli ultravioletti. Questa è una tecnica che ci consente anche di separare frammenti diversi. Abbiamo un’altra variante della PCR che si chiama RFLP-PCR è una pcr accoppiata ad una digestione nzimatica che consente di vedere dei polimorfismi di restrizione. Il polimorfismo deriva da una mutazione, in generale ci riferiamo a sostituzione di coppia nucleotidica che possiamo mettere in evidenza con questa tecnica quando questa mutazione (lo sneep), che non si chiama più mutazione nel momento in cui è presente nella popolazione generale con una percentuale maggiore dell’1,5%, in media tale polimorfismo se ricade in un sito di restrizione ad esempio sottraendolo o aggiugendolo può essere messo in evidenza. Ad esempio l’anemia falciforme è una patologia che deriva da una mutazione puntiforme che allo stato di omozigote, in una catena, polipeptidica cambia totalmente la struttura terziaria e quaternaria dell’emoglobina per cui a basse pressioni di ossigeno il globulo rosso assume una forma a falce e di solito può andare in contro ad emolisi. È una missenso che cambiando l’amminoacido cambia la conformazione della catena β della proteina. Quando ci sono queste mutazioni queste possono ricadere in un sito come quello di restrizione. Nel caso dell’anemia falciforme la mutazione ricade in un sito di restrizione, cioè in realtà in quella regione ha un sito di restrizione per un enzima in questo caso chiamiamo Dde1. Se cade in questo punto succede che quando vado a digerire l’enzima di restrizione, mentre l’allele normale si riesce a tagliare in due punti perché c’è l’enzima e ottengo due frammenti uno di 175 e uno di 201, quando taglio
l’allele mutato non riesco a tagliarlo perché il sito è scomparso perché è cambiata una coppia nucleotidica. Allora se voglio screenare una popolazione per questa mutazione io posso amplificare il gene di interesse, in questo caso il gene per la β globina, segue a questa pcr una digestione enzimatica da qui RFLP pcr dopo di che se abbiamo 3 campioni di 100 che sono stati trattati alla stessa maniera, utilizzo un gel di agarosio. Carico i campioni , vado ad applicare elettroforesi e quello che si vede a distanza di 20 min è che un frammento è pesante 376bp poi il paziente numero 2 invece mi da 2 frammenti di 175 e 201 il terzo mi da dsia i due frammenti che quello pesante. Che cosa è successo? Il paziente uno presenta la mutazione in omozigosi quindi ha 2 alleli entrambi mutati, il 2 campione da 2 frammenti quindi questo appartiene ad un soggetto che presenta una condizione while type su entrambi gli alleli; il terzo presenta un allela while type e l’altro mutato. Se consideriamo i 3 profili e uno di questi viene osserviamo in 100 pazienti abbiamo un polimorfismo di restrizione. Così facendo abbiamo potuto mettere a confronto i campioni attraverso una tecnica detta RFLPpcr che mette in confronto lunghezza di frammenti di restrizione diversi. Questo è un esempio di polimorfismo che ricade modificando un sito di restrizione o aggiungendolo o sottraendolo (in questo caso lo abbiamo sottratto). Normalmente la RFLP pcr è una tecnica che si utilizza più per la ricerca che per la diagnostica. Questo perché l’enzima di restrizione è una proteina molto delicata, è conservata in glicerolo a circa -20° C. Ma la manipolazione lo può alterare. Per diagnosi non si usa più per questa ragione se l’operatore non lo sa maneggiare quando digerisco il DNA si rischia di non digerirlo e si pensa di avere una mutazione che in realtà non è presente. Per questo viene utilizzato lo stesso principio con la sonda molecolare . SONDA MOLECOLARE Con il termine sonda si può fare riferimento a diversi tipi di sonda, ma il termine molecolare si riferisce a una sonda costituita da acido nucleico. Una sonda è sempre una singola elica di acido nucleico marcata in 5’. Quindi ciò vuol dire che è possibile vedere dove va il DNA perché si segue la fluorescenza della sonda. La sonda deve essere a singola elica perché essa serve per identificare in un pool di frammenti di DNA quello di nostro interesse. E questo la sonda lo individua e si appaia con esso perché è complementare. Per cui per poter disegnare una sonda è importante conoscere la sequenza di DNA di nostro interesse in modo tale che la sonda sia complementare ad essa. Inoltre la sonda deve essere rintracciabile e per fare ciò si può utilizzare il radioattivo o la fluorescenza. Se abbiamo due molecole di DNA se vogliamo creare degli ibridi viene denaturata la molecola di DNA e poi viene messa a contatto con una porzione di elica che disegna l’operatore marcata e poi si abbassa la